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磁珠法核酸提取及常見(jiàn)的6種誤區(qū)

2021.02.04 3930次 作者:admin 來(lái)源:

人類對(duì)核酸物質(zhì)的了解始于1869年,這一年Friederich Miescher從白細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出一種他稱之為“核素”的化學(xué)物質(zhì),這是人類歷史上第一次有目的地提取細(xì)胞內(nèi)的核物質(zhì),然而當(dāng)時(shí)采用的方法十分簡(jiǎn)單,僅僅是通過(guò)改變?nèi)芤旱乃釅A度,核酸便從酸性溶液中沉淀出來(lái)。這也是最早對(duì)核酸性質(zhì)的描述,即是一種溶于堿性溶液,但不溶于酸性溶液的物質(zhì)。

 

1953年,Watson和Crick闡明了DNA的結(jié)構(gòu),從此開(kāi)啟了分子生物學(xué)的元年。此后不久,出現(xiàn)了分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序。1958年,發(fā)現(xiàn)DNA半保留復(fù)制原理的Meselson和Stahl開(kāi)創(chuàng)性地應(yīng)用密度梯度離心法獲得DNA。這種方法利用離心力場(chǎng)中各組分的浮力密度差不同的原理進(jìn)行DNA純化。由于銫離子(Cs)相對(duì)于水的密度更大,施加到CsCl溶液的超高離心力導(dǎo)致形成密度梯度。核酸在這個(gè)梯度上遷移,直到達(dá)到中性浮力,即等密度點(diǎn)。該方法具有以低成本提供非常純的高產(chǎn)DNA的優(yōu)點(diǎn)。


其它的液相純化方法還包括經(jīng)典的苯酚-氯仿法、CTAB法等。


但直到二十世紀(jì)90年代,DNA提取仍然是耗時(shí)、繁瑣、低效率的操作。1989年,McCormick建立了一種用酚化的二氧化硅吸附去除蛋白質(zhì)的基因組DNA提取方法。它類似經(jīng)典的酚/氯仿提取法,即用酚化的二氧化硅酚代替酚,這是最早出現(xiàn)的固相吸附提取方法。相比起液相抽提,固相吸附法的優(yōu)勢(shì)很明顯,因此傳統(tǒng)的液相分離提取核酸方法逐漸被以固相吸附支持物為基礎(chǔ)的新方法所取代。目前常見(jiàn)固相材料有硅膠、玻璃顆粒、硅藻土、陰離子交換載體等。但固相法通常需采取數(shù)次快速離心、真空抽濾等步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)分離,而且對(duì)于樣本需求量大,耗費(fèi)樣品較多,不便于高通量、自動(dòng)化操作,嚴(yán)重限制了在臨床基因診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。


理想的核酸提取方法應(yīng)該滿足以下4個(gè)條件:

1)靈敏、快速、簡(jiǎn)單、重復(fù)性好;

2)產(chǎn)物純度較高,不影響后續(xù)步驟

3)環(huán)保、無(wú)毒害

4)無(wú)交叉污染風(fēng)險(xiǎn)


為了適應(yīng)現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)高通量、高靈敏度、自動(dòng)化操作的需要,磁珠法應(yīng)運(yùn)而生。第一個(gè)利用磁珠法提取DNA的并且在美國(guó)成功申請(qǐng)專利的商品化試劑出現(xiàn)在1998年。磁珠法先通過(guò)裂解細(xì)胞,將游離出來(lái)的核酸分子特異地吸附到磁性顆粒表面,而蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)則留在溶液中;在外加磁場(chǎng)的作用下,磁性顆粒與液體分開(kāi),棄除液體后,再經(jīng)洗脫即得到純化的核酸分子。


磁珠法利用了磁性顆?;钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理,盡可能地避免了提取過(guò)程中核酸的丟失,還能很好地去除標(biāo)本中存在的干擾物質(zhì)(如血紅蛋白、膽紅素及脂血等因素)影響,獲得質(zhì)量較高的核酸模板。隨著磁珠法提取技術(shù)的發(fā)展,DNA提取才真正開(kāi)始實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、快速化和自動(dòng)化。


而基于磁珠法提取的商業(yè)試劑盒也得到廣泛應(yīng)用。這種試劑盒不需要任何有機(jī)溶劑,無(wú)需重復(fù)離心,目前可以從全血、血清、血漿、唾液、尿液、糞便、腦脊液、組織和細(xì)胞中提取高質(zhì)量的DNA和RNA,且耗時(shí)更短、回收率更高。最顯著的優(yōu)勢(shì)是可以通過(guò)機(jī)械設(shè)備實(shí)現(xiàn)提取過(guò)程自動(dòng)化和無(wú)人源干擾。


近年來(lái)分子診斷技術(shù)快速發(fā)展,隨著基因測(cè)序等技術(shù)的成熟,成本進(jìn)一步降低,在臨床上的應(yīng)用也越來(lái)越普遍。分子診斷檢測(cè)的樣本類型多達(dá)數(shù)十種,而處理后產(chǎn)物適用的檢測(cè)項(xiàng)目也涵蓋了熒光定量PCR、基因測(cè)序、基因芯片、生物質(zhì)譜等各類分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)。然而,無(wú)論是哪一類檢測(cè)項(xiàng)目,準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)疑依賴于高質(zhì)量的標(biāo)本及標(biāo)本前處理過(guò)程。因此臨床分子診斷自動(dòng)化趨勢(shì)將逐步在國(guó)內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室成為主導(dǎo),而自動(dòng)化首先將在目前手工操作較普及且對(duì)結(jié)果影響最大的核酸提取上實(shí)現(xiàn)。磁珠法提取試劑加自動(dòng)核酸提取儀,就成為解決臨床分子診斷樣品前處理的完美組合。


然而,使用生物磁珠提取核酸的過(guò)程中,也存在著一些誤區(qū)。


01

誤區(qū)1:磁珠越多,提取效果越好


有很多老師喜歡在提取效果不佳的時(shí)候,增加磁珠的用量,認(rèn)為磁珠多加一點(diǎn),就能吸上更多的核酸,不得不說(shuō)這種想法是不可取的。

磁珠的主要特點(diǎn)是既可以分散于液體中,也可以在外加磁場(chǎng)作用下以固態(tài)方式和液相分離,任何試劑體系,磁珠和液體的比例都應(yīng)該是有一定閾值的,超過(guò)一定的比例,過(guò)多的磁珠將因?yàn)闊o(wú)法均勻分散于液體中,而喪失其分散的特性,也使得洗滌過(guò)程中無(wú)法充分增加核酸磁珠和液體接觸的效率。
而過(guò)量的磁珠也會(huì)吸附更多的雜質(zhì),對(duì)于除雜的效果影響非常大。甚至有些時(shí)候,過(guò)多的磁珠會(huì)吸附蛋白酶、溶菌酶等在液體體系中起主要作用的功能成分,導(dǎo)致整個(gè)試劑盒效率低下。有很多時(shí)候,在提取效果不佳的時(shí)候,減少磁珠使用量,反而是提升提取效果的最優(yōu)途徑。

通常情況下,磁珠法試劑盒給出的參考磁珠用量都是略微過(guò)量的,因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的情況并不多,但如果確定是磁珠用量不足導(dǎo)致的提取效果不好,是可以在一定范圍內(nèi)通過(guò)增加磁珠用量來(lái)改善提取效果的。
02

誤區(qū)2:試劑使用的越多,提取效果越好


裂解效果不好?多加點(diǎn)裂解液。洗滌效果不好?多加點(diǎn)洗滌液。這是很多客戶在使用試劑盒中的慣性思維。

但是對(duì)于磁珠法而言,每增加一部分液體體積,就減少了更多的磁珠碰撞幾率,而降低磁珠碰撞幾率,會(huì)導(dǎo)致吸附率的大幅度下降。所以很多時(shí)候,雖然增加裂解液和洗滌液確實(shí)能夠起到增強(qiáng)裂解和增強(qiáng)洗滌的作用,但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,無(wú)法保證磁珠碰撞效率是不能保證核酸提取效率的,所以單純?cè)黾釉噭┦褂昧扛纳铺崛⌒Ч⒉灰欢ㄍ耆行А?/span>

03

誤區(qū)3:洗滌次數(shù)越多,提取效果越好


提取得到的核酸雜質(zhì)過(guò)多時(shí),使用者會(huì)考慮多進(jìn)行幾次洗滌,以得到更為純凈的核酸。增加洗滌次數(shù)確實(shí)有利于提純核酸,但考慮到每次洗滌都會(huì)損失一定量的核酸,且增加了核酸斷裂水解的可能性,所以一般來(lái)說(shuō)洗滌次數(shù)控制在2~4次為宜。


04

誤區(qū)4:樣本取用的越多,提取效果越好


在樣本不夠新鮮或者核酸含量本身就很少的情況下,往往核酸提取效果不好,很多老師就會(huì)采用多取樣本的方式增加核酸提取量。

但簡(jiǎn)單地增加樣本取樣量,有時(shí)會(huì)引入過(guò)多的雜質(zhì),超出裂解液裂解能力,也會(huì)使提取效率降低,所以并不推薦通過(guò)簡(jiǎn)單的增加樣本取樣量的方式來(lái)達(dá)到增加提取量的目的。
如果確實(shí)是由于樣本量不足而引起的提取量過(guò)低,建議在前處理先經(jīng)過(guò)富集或者濃縮步驟再開(kāi)始提取?;蛘咴黾恿呀獾耐耆?,使更多的核酸暴露出來(lái)也是一種解決方法。
05

誤區(qū)5:某一種磁珠好,就應(yīng)該在所有試驗(yàn)中效果都好


磁珠的種類是多種多樣的,粒徑大小不同,分散性不同,磁響應(yīng)時(shí)間不同,包被基礎(chǔ)基質(zhì)不同,外層修飾官能團(tuán)不同,包被密度不同,官能團(tuán)臂長(zhǎng)不同,會(huì)導(dǎo)致磁珠特性千差萬(wàn)別。
所以不同磁珠所適應(yīng)的實(shí)驗(yàn)和體系也是不同的。就像同樣是核酸提取的試劑,配方也并不完全相同,同樣應(yīng)用于核酸提取的磁珠,性質(zhì)也并非完全一致。
有的磁珠在常量核酸提取中表現(xiàn)出了更高的吸附效率,有的磁珠更適用于微量核酸提取。有的磁珠適合偏酸性系列的試劑體系,有的磁珠適合偏堿性系列的試劑體系。有的磁珠磁響應(yīng)性好但是沉降速度快,更適合磁棒式自動(dòng)提取儀;有的磁珠沉降速度慢但是磁響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),更適合移液式自動(dòng)提取儀。
很少有一種磁珠能適用于所有實(shí)驗(yàn)的情況,除了固定的試劑盒配合,多數(shù)情況下,磁珠和試劑體系都要做一定時(shí)間的配合調(diào)整。
06

和某種試劑盒對(duì)比效果不好,就是磁珠不好


很多客戶在篩選磁珠過(guò)程中都是在已經(jīng)成熟試劑體系下,簡(jiǎn)單地等量替換磁珠,用于比較磁珠效果。
這樣就會(huì)很容易得出某種磁珠效果不好的結(jié)論,但實(shí)際上,由于不同磁珠適合的體系和用量是不同的,往往需要調(diào)整過(guò)后才能獲得更好的提取效果。
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