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人類對(duì)核酸物質(zhì)的了解始于1869年,這一年Friederich Miescher從白細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出一種他稱之為“核素”的化學(xué)物質(zhì),這是人類歷史上第一次有目的地提取細(xì)胞內(nèi)的核物質(zhì),然而當(dāng)時(shí)采用的方法十分簡(jiǎn)單,僅僅是通過(guò)改變?nèi)芤旱乃釅A度,核酸便從酸性溶液中沉淀出來(lái)。這也是最早對(duì)核酸性質(zhì)的描述,即是一種溶于堿性溶液,但不溶于酸性溶液的物質(zhì)。
1953年,Watson和Crick闡明了DNA的結(jié)構(gòu),從此開(kāi)啟了分子生物學(xué)的元年。此后不久,出現(xiàn)了分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序。1958年,發(fā)現(xiàn)DNA半保留復(fù)制原理的Meselson和Stahl開(kāi)創(chuàng)性地應(yīng)用密度梯度離心法獲得DNA。這種方法利用離心力場(chǎng)中各組分的浮力密度差不同的原理進(jìn)行DNA純化。由于銫離子(Cs)相對(duì)于水的密度更大,施加到CsCl溶液的超高離心力導(dǎo)致形成密度梯度。核酸在這個(gè)梯度上遷移,直到達(dá)到中性浮力,即等密度點(diǎn)。該方法具有以低成本提供非常純的高產(chǎn)DNA的優(yōu)點(diǎn)。
其它的液相純化方法還包括經(jīng)典的苯酚-氯仿法、CTAB法等。
但直到二十世紀(jì)90年代,DNA提取仍然是耗時(shí)、繁瑣、低效率的操作。1989年,McCormick建立了一種用酚化的二氧化硅吸附去除蛋白質(zhì)的基因組DNA提取方法。它類似經(jīng)典的酚/氯仿提取法,即用酚化的二氧化硅酚代替酚,這是最早出現(xiàn)的固相吸附提取方法。相比起液相抽提,固相吸附法的優(yōu)勢(shì)很明顯,因此傳統(tǒng)的液相分離提取核酸方法逐漸被以固相吸附支持物為基礎(chǔ)的新方法所取代。目前常見(jiàn)固相材料有硅膠、玻璃顆粒、硅藻土、陰離子交換載體等。但固相法通常需采取數(shù)次快速離心、真空抽濾等步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)分離,而且對(duì)于樣本需求量大,耗費(fèi)樣品較多,不便于高通量、自動(dòng)化操作,嚴(yán)重限制了在臨床基因診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。
理想的核酸提取方法應(yīng)該滿足以下4個(gè)條件:
1)靈敏、快速、簡(jiǎn)單、重復(fù)性好;
2)產(chǎn)物純度較高,不影響后續(xù)步驟
3)環(huán)保、無(wú)毒害
4)無(wú)交叉污染風(fēng)險(xiǎn)
為了適應(yīng)現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)高通量、高靈敏度、自動(dòng)化操作的需要,磁珠法應(yīng)運(yùn)而生。第一個(gè)利用磁珠法提取DNA的并且在美國(guó)成功申請(qǐng)專利的商品化試劑出現(xiàn)在1998年。磁珠法先通過(guò)裂解細(xì)胞,將游離出來(lái)的核酸分子特異地吸附到磁性顆粒表面,而蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)則留在溶液中;在外加磁場(chǎng)的作用下,磁性顆粒與液體分開(kāi),棄除液體后,再經(jīng)洗脫即得到純化的核酸分子。
磁珠法利用了磁性顆?;钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理,盡可能地避免了提取過(guò)程中核酸的丟失,還能很好地去除標(biāo)本中存在的干擾物質(zhì)(如血紅蛋白、膽紅素及脂血等因素)影響,獲得質(zhì)量較高的核酸模板。隨著磁珠法提取技術(shù)的發(fā)展,DNA提取才真正開(kāi)始實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、快速化和自動(dòng)化。
而基于磁珠法提取的商業(yè)試劑盒也得到廣泛應(yīng)用。這種試劑盒不需要任何有機(jī)溶劑,無(wú)需重復(fù)離心,目前可以從全血、血清、血漿、唾液、尿液、糞便、腦脊液、組織和細(xì)胞中提取高質(zhì)量的DNA和RNA,且耗時(shí)更短、回收率更高。最顯著的優(yōu)勢(shì)是可以通過(guò)機(jī)械設(shè)備實(shí)現(xiàn)提取過(guò)程自動(dòng)化和無(wú)人源干擾。
近年來(lái)分子診斷技術(shù)快速發(fā)展,隨著基因測(cè)序等技術(shù)的成熟,成本進(jìn)一步降低,在臨床上的應(yīng)用也越來(lái)越普遍。分子診斷檢測(cè)的樣本類型多達(dá)數(shù)十種,而處理后產(chǎn)物適用的檢測(cè)項(xiàng)目也涵蓋了熒光定量PCR、基因測(cè)序、基因芯片、生物質(zhì)譜等各類分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)。然而,無(wú)論是哪一類檢測(cè)項(xiàng)目,準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)疑依賴于高質(zhì)量的標(biāo)本及標(biāo)本前處理過(guò)程。因此臨床分子診斷自動(dòng)化趨勢(shì)將逐步在國(guó)內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室成為主導(dǎo),而自動(dòng)化首先將在目前手工操作較普及且對(duì)結(jié)果影響最大的核酸提取上實(shí)現(xiàn)。磁珠法提取試劑加自動(dòng)核酸提取儀,就成為解決臨床分子診斷樣品前處理的完美組合。
然而,使用生物磁珠提取核酸的過(guò)程中,也存在著一些誤區(qū)。
誤區(qū)1:磁珠越多,提取效果越好
誤區(qū)2:試劑使用的越多,提取效果越好
誤區(qū)3:洗滌次數(shù)越多,提取效果越好
誤區(qū)4:樣本取用的越多,提取效果越好
誤區(qū)5:某一種磁珠好,就應(yīng)該在所有試驗(yàn)中效果都好
和某種試劑盒對(duì)比效果不好,就是磁珠不好